细胞株培养技术的分享

细胞株的传代培养方法：

1、材料准备及实验步骤
仪器：CO2培养箱、倒置显微镜、安全柜
材料：Corning细胞培养瓶、试管、移液管、巴士德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯、培养的细胞。
试剂：培养基RPMI1640(Corning10-040-CVR)、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、Hanks液(Corning 21-020-CVR)。
实验步骤：
① 入无菌室之前用肥皂洗手，再用75% 的酒精擦拭消毒双手;
② 倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否传代及细胞需要稀释的倍数。 将培养用液37℃下预热。
③ 超净台台面应整洁，用75%酒精棉球擦拭清洁;
④ 打开超净工作台的紫外灯照射台面20min左右，关闭紫外灯，打开风机清洁空气除去臭氧;
⑤ 点燃酒精灯;取出无菌试管，巴士德吸管和刻度吸管;安上橡皮头;过酒精灯火焰略烧后插在无菌试管内。
⑥ 将培养用液瓶口用75%酒精消毒，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。
⑦ 倒掉培养细胞的旧培养基。酌情可用2-3ml Hanks液洗去残留的就培养基，或用少量胰酶涮洗一下。
⑧ 每个大培养瓶加入1ml胰酶，小培养瓶用量酌减，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察。当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉。注意勿使细胞提早脱落入消化液中。
⑨ 加入少量的含血清的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基(7-10ml/大瓶;3-5ml/小瓶)制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中。盖好瓶盖，适度拧紧后稍回转，以利于CO2的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。
⑩ 对悬浮培养细胞，步骤7-9不做。直接将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。
2、注意事项
① 传代培养时注意无菌操作并防止细胞间的交叉污染。所有操作尽量靠近酒精灯火焰。每次只进行一种细胞的操作。每种细胞使用一套器材。
② 每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。
③ 如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应弃置污染的细胞，如果必须挽救，可加含有抗生素的BBS或培养基反复清洗，随后培养基中加入较大量的抗生素，并经常更换培养基。
3、传代细胞的建系和维持
细胞系的维持通过换液传代再换液、再传代和细胞种子冻存来实现。
对每一个细胞株来说都有其自身的特点，要做好建系的维持必须记录好细胞档案,换液传代和做好细胞系(或株)的鉴定和管理工作。
BR    Bile powder of pig    100克    猪胆汁粉
BR    OX Bile dihydrate purified    250克    脱氢牛胆粉
BR    Beef extract powder    250克    小牛浸膏粉
BR    Yeast extract powder    250克    酵母粉
        500克    
BR    Yeast extract    500克    酵母浸膏
BR，90%    Bile salt No. 3    25克    3号胆盐
BR，70%    Bile salt No. 5    25克    5号胆盐
BR    Bile salt No.7    25克    7号胆盐
BR    Bile salt from sheep    25克    羊胆盐
BR，60%    Bile salt from ox    25克    牛胆盐
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