荧光定量试剂盒,特别是基于SYBR Green I的荧光定量PCR试剂盒,是用于实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)的专用试剂。它广泛应用于分子生物学、医学研究、疾病诊断、遗传分析等领域,用于检测特定DNA或RNA序列的拷贝数,通常建议在-20℃条件下保存,以确保其长期稳定性。部分试剂盒在4℃条件下也可短期保存,但长期保存可能导致性能下降。
荧光定量试剂盒通常包含以下关键组分:
PCR Buffer:提供适宜的pH值和离子强度,确保DNA聚合酶的活性。
MgCl2:作为DNA聚合酶的辅因子,参与PCR反应。
dNTPs:脱氧核糖核酸三磷酸,是DNA合成的原料。
热启动DNA聚合酶:如HS Taq DNA Polymerase,经过特殊化学修饰,在低温下保持非活性状态,防止非特异性扩增,提高PCR反应的特异性。
荧光定量试剂盒的使用通常包括以下几个步骤:
解冻与混匀:将试剂盒中的组分从冰箱中取出,解冻并充分混匀,避免产生气泡。
配制反应体系:根据实验需求,将荧光染料、PCR Buffer、MgCl2、dNTPs、热启动DNA聚合酶、引物、模板DNA和水等组分按一定比例混合,形成PCR反应体系。
设置PCR程序:在荧光定量PCR仪上设置合适的PCR程序,包括预变性、变性、退火/延伸等步骤,以及荧光信号检测参数。
运行PCR反应:将配制好的PCR反应体系加入PCR管中,放入荧光定量PCR仪中运行程序。
数据分析:反应结束后,利用荧光定量PCR仪的软件对收集到的荧光信号进行分析,得到目的序列的拷贝数。
荧光定量试剂盒具有以下特性与优势:
高特异性:采用热启动DNA聚合酶和化学修饰技术,有效抑制非特异性扩增和引物二聚体的生成。
高灵敏度:能够检测DNA或RNA序列,适用于微量样本的分析。
通用性好:与多种荧光定量PCR仪兼容,适用于不同的实验平台和需求。
操作简便:预混的试剂体系减少了实验步骤和配错风险,提高了实验效率。