细胞系转染样品的处理步骤

1.细胞系将处理好的盖玻片放在12孔板底部

如果细胞贴壁不牢（如HEK293）或者是半贴壁细胞（如 PC12），可以用细胞刮子将鼠尾胶原均匀地涂抹在玻片上包被。也可使用多聚赖氨酸，但是效果不如鼠尾胶原。事实上大部分贴壁的细胞都不用进行包被。如果在操作中发现细胞脱片严重，则可考虑进行包被来提高细胞贴壁能力。

2.将与培养基混匀后的细胞悬液加入孔中

这一步混匀非常重要，如果不匀，一般细胞都会聚集在玻片中央区域，会对形态观察产生不利影响。分细胞的时候要注意进行形态观察的时候应该将细胞分得相对稀一些，密集的细胞不利于形态观察。每孔细胞的数量根据细胞大小的不同应该作出相应调整，一般104个细胞即可。

3.待24h后，细胞贴壁，即可进行转染

初次试验建议转染阳性的表达质粒作为阳性对照来监测转染效率和染色操作，并且要分别设单转染和共转染孔来方便一种蛋白影响另一种蛋白表达时的结果分析，所以转染的时候一共要设以下孔：①ProteinA-V5；②ProteinB-MYC；③ProteinA-V5+ProteinB-MYC；④Positive-V5；⑤Positive-MYC。

因为细胞分得较稀，所以对于转染试剂的毒性也会更加敏感，所以有时候有必要将转染试剂和质粒减量。

4.转染完成大于24--48h后，固定用PBS将细胞洗3遍，每遍 5min，如果细胞贴壁不牢（如HEK293）或者是半贴壁细胞（如 PC12），应该将12孔板倾斜，将PBS从低处缓缓加入，再平放，以免使细胞脱片。然后加入4%多聚甲醛固定液（如果细胞贴壁不牢，必须以同样的轻柔方式），室温固定10--15min，如果细胞贴壁不牢（如HEK293PC12），应该将12孔板倾斜，从低处缓缓加入，再平放，以免使细胞脱片。过长时间的固定会影响蛋白的免疫原性，对于细胞来说10--15min的固定已经足够。

5.用PBS将细胞洗3遍，每遍5min

方法同前

6.细胞透化

室温下，0.5% TritonX10/PBS透化处理10min。时间过长或者强度过高的透化有可能会破坏细胞的膜结构，对于细胞来说我们提供的透化已经足够用于全细胞染色。

7.用4℃预冷的PBS将细胞洗3遍，每遍5min

8.封闭

以3% BSA/PBS封闭，37℃，30min或4℃ 过夜。这里我们推荐37℃，30min。此步主要用于封闭非特异蛋白质结合位点。也可以使用正常的鼠、兔、羊等与抗体相对应的正常血清作为封闭剂，使用的时候要进行适当的稀释。

9.PBS将细胞洗一遍

方法同前。如细胞易脱落也可以不洗。

10.一抗孵育

在每孔中加入50μl以PBS按一定的稀释度稀释的一抗。（一般参考抗体说明书上推荐的浓度，例如Invitrogen公司的V5抗体，我们使用1∶10耀1∶20的稀释度；如果进行双免疫荧光分析则可以同时加入两种一抗。）在盖玻片上盖一层封口膜（15ml离心管在封口膜上扣下的印迹可以作为裁剪封口膜的边界），于湿盒中，37℃，30min或者4℃过夜。4℃过夜的一抗孵育有利于抗体和抗原蛋白充分结合，这里推荐大家使用4℃过夜作为一抗孵育的实验条件。

当然也可以使用多加抗体稀释液的方法，但是这样比较浪费抗体。事实上4℃过夜孵育用过的抗体还可以被回收使用，这种方法在商品化抗体价格高昂的情况下还是有一定实用价值的，不过关键实验中不推荐。

11.用4℃预冷的PBS将细胞洗3遍，每遍5min，洗去多余的一抗

方法同前

12.二抗孵育

在孔中加入50μl以PBS按1∶50稀释的荧光素标记的二抗（选用中杉抗体作为参考，如果进行双免疫荧光分析则同时加入两种二抗），在盖玻片上盖一层封口膜，湿盒中，37℃，30min（推荐）或者4℃过夜。一般来说二抗还可以稀释以取得更加特异的染色效果。

13.用4℃预冷的PBS将细胞洗3遍，每遍5min方法同前

14.双蒸水将细胞洗3遍，每遍5min

15.如果需要染核，在细胞上滴加DAPI工作液，如果不需要，可直接进行乙醇漂洗如果细胞贴壁不牢（如HEK293PC12），应该将12孔板倾斜，从低处缓缓加入，再平放，以免使细胞脱片。

16.甲醇漂洗

17.乙醇漂洗

18.用针头将在乙醇中的玻片撬起一侧，用镊子将玻片取出放在滤纸上晾干

19.封片：取8μl封片剂滴在载玻片上，将盖玻片有细胞的一面朝下封片。封片剂不能多加，否则玻片会滑动

20.待封片剂均匀分布于盖玻片下，即可周围用指甲油封住（指甲油也只能加适量）为了取得*的染色效果，有时候有必要将一抗、二抗进行梯度稀释，再进行组合用来对细胞进行免疫荧光染色。例如，一抗：1∶50，1∶10，1∶20，1∶40；二抗：1∶10，1∶20通过这样的方法得到的染色片在倒置荧光显微镜下信号清晰明亮、本底低、对比明显，才能满足激光共聚焦显微镜观察的要求。因为激光共聚焦显微镜逐点扫描特定焦平面各点，所以在目镜下弱的信号一般都很难被采集到。

另外细胞系需要注意的一点，在实际操作中和文献报道中我们发现有可能两种蛋白不能一起过表达，即共转染的时候只能得到一种蛋白的过表达产物，这样的情况下就无法使用这种方法。
53016-31-2     去乙酰基诺孕酯标准品    Deacetylnorgestimate    25mg
5297-17-6     氯琥珀酰单胆碱标准品    Succinylmonocholine Chloride    150mg
529-59-9     染料木苷标准品    Genistin    30mg
52-86-8     氟哌啶醇标准品    Haloperidol     200mg
528-58-5    氯化花青素标准品    Cyanidin Chloride    25mg
527-75-3    红霉素B标准品    Erythromycin B    100mg
52-76-6     利奈孕醇标准品    Lynestrenol    20mg
5270-74-6    氯噻酮相关物质A标准品        10mg
52699-48-6     醋酸戈那瑞林标准品    Gonadorelin Acetate    50mg
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