对淋巴细胞系进行体外刺激预孵育、或板内同步刺激培养

1、将抗原和淋巴细胞系在体外混合，刺激并预孵育，是通用的方法。预孵育的淋巴细胞，在置入ELISPOT板之前应使用复温到37℃的培养液清洗细胞1-2次。置入ELISPOT板以后通常在37℃培养5～6小时。

2、对于高度特异性抗原，可以采用将淋巴细胞和抗原同时加入ELISPOT板孔中，37℃培养箱中，同步进行刺激、培养、和细胞因子捕获。淋巴细胞板内同步刺激培养的时间通常为22～24小时。

3、ELISPOT试验检测的是每一个分泌细胞系因子的活化细胞。在培养细胞过程中，任何移动、震动（包括开关培养箱门）都会导致细胞在培养板上的移动，从而得到不规则斑点或者斑点花纹，影响zui终结果。因此细胞在ELISPOT培养板孵育的过程中，应注意保持培养板的静置，不应对其移动。

4、在使用抗原刺激淋巴细胞培养过程中发现培养液变黄，这种现象通常见于使用很强的多克隆抗原刺激淋巴细胞，某些多克隆抗原会导致淋巴细胞凋亡或者死亡，大量淋巴细胞死亡后使培养液变黄。使用这些淋巴细胞进行后续ELISPOT试验通常得到很低的斑点（SPOT）形成。换用特异性抗原后可以避免该现象。

5、在ELISPOT结果中出现不规则的大块斑点，有的区域没有斑点的原因，不规则斑点区域的出现一般是细胞分离不*所至，有时候采用多克隆抗原孵育的淋巴细胞也会产生成团现象。请确认加入到ELISPOT板中进行孵育的是单细胞悬液。

6、使用开口较大的吸头，动作轻柔，避免对细胞系的吹打，减少剪切力对淋巴细胞的伤害。