过氧化物酶标记测定法原理

肿瘤细胞原理：脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛[(digoxigenin)-11-dUTP]在TdT酶的作用下,可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH末端,与dATP形成异多聚体,并可与连接了报告酶(过氧化物酶或碱性磷酸酶)的抗地高辛抗体结合.在适合底物存在下,过氧化物酶可产生很强的颜色反应,特异准确的定位出正在凋亡的细胞,因而可在普通光学显微镜下进行观察.

毛地黄植物是地高辛的*来源.在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭体结合的配体,因而非特异性反应很低.抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物甾体激素的交叉反应不到1%,若此抗体的Fc部分通过蛋白酶水解的方法除去后,则可*排除细胞Fc受体非特异性的吸附作用.

(一)试剂配制

1、磷酸缓冲液PBS(pH7.4)：磷酸钠盐 50mM,NaCl 200mM.

2、蛋白酶K(200μg/ml,pH7.4)：蛋白酶K 0.02g;PBS 100ml.

3、含2%H2O2的PBS缓冲液(pH7.4)：H2O2 2.0ml;PBS缓冲液 98.0ml.

4、TdT酶缓冲液(新鲜配)：Trlzma碱 3.63g用 0.1N HCl调节pH至 7.2,加ddH2O定容到1000ml;

5、TdT酶反应液：TdT酶32μl;TdT酶缓冲液 76μl,混匀,置于冰上备用.

6、洗涤与终止反应缓冲液：氯化钠 17. 4g;柠檬酸钠 8.82g;ddH2O 1000ml

7、0.05%二氨基联苯(DAB)溶液：DAB 5mg;PBS 10ml,pH7.4, 临用前过滤后,加过氧化氢至0.02%.

8、0.5%甲基绿(pH4.0)：甲基绿0.5g;0.1M乙酸钠100ml.

9、100%丁醇,100%、95%、90%、80%和70%乙醇,二甲苯,10%中性甲醛溶液,乙酸,松香水等.

10、过氧化物酶标记的抗地高辛抗体(ONCOR)

(二)肿瘤细胞实验步骤

1、标本预处理：

(1)石蜡包埋的组织切片预处理：将组织切片置于染色缸中,用二甲苯洗两次,每次5min.用无水乙醇洗两次,每次3min.用95%和75%乙醇各洗一次,每次3min.用PBS洗5min 加入蛋白酶K溶液(20ug/ml),于室温水解15min,去除组织蛋白.用蒸馏水洗4次,每次2min,然后按下述步骤2进行操作.

(2)冰冻组织切片预处理：将冰冻组织切片置10%中性甲醛中,于室温固定10min后,去除多余液体.用PBS洗两次,每次5min.置乙醇：乙酸(2：1)的溶液中,于-20℃处理5min,去除多余液体.用PBS洗两次,每次5min,然后按下述步骤2进行操作.

(3)培养的或从组织分离的细胞的预处理：将约 5 × 107个/ml细胞于 4%中性甲醛室温中固定 10min.在载玻片上滴加 50～100μl细胞悬液并使之干燥.用PBS洗两次,每次5min,然后按下述步骤2进行操作.

2、色缸中加入含2%过氧化氢的PBS,于室温反应5min.用PBS洗两次,每次5min.

3、用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体,立即在切片上加2滴 TdT酶缓冲液,置室温1～5min.

4、用滤纸小心吸去切片周围的多余液体,立即在切片上滴加 54μl TdT酶反应液,置湿盒中于37C反应 1hr(注意：阴性染色对照,加不含TdT酶的反应液).

5、将切片置于染色缸中,加入已预热到37℃的洗涤与终止反应缓冲液,于37℃保温30min,每10min将载玻片轻轻提起和放下一次,使液体轻微搅动.

6、组织切片用PBS洗 3次,每次 5min后,直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体,于湿盒中室温反应30min.

7、用PBS洗4次,每次5min.

8、在组织切片上直接滴加新鲜配制的0.05%DAB溶液,室温显色3～6min.

9、用蒸馏水洗4次,前3次每次1min,zui后1次5min.

10、于室温用甲基绿进行复染10min.用蒸馏水洗3次,前两次将载玻片提起放下10次,zui后1次静置30s.依同样方法再用100%正丁醇洗三次.

11、用二甲苯脱水3次,每次2min,封片、干燥后,在光学显微镜下观察并记录实验结果.

(三)肿瘤细胞注意事项

细胞凋亡检测试验中一定要设计阳性和阴性对照样本。可以采用不加TdT酶的作为阴性对照组，利用DNaseI部分降解的细胞作为阳性对照组。