如何进行人表皮角质形成细胞的传代培养

1如何进行人表皮角质形成原代细胞的传代培养？
问＆答-------------------------------------------
皮肤不但是人体的生理屏障，而且在机体免疫和内分泌等方面起着极其重要的作用。角质形成细胞是表皮细胞的主要组成部分，角质形成细胞的体外培养可为皮肤毒理学、烧伤治疗学、美容学和皮肤病发病机制的研究提供新的途径。那么该如何进行人表皮角质形成细胞的传代培养？
1.达到60%～75%的融合后，移去培养基，单层细胞使用10ml 1：5000乙二胺四乙酸(Versene)冲洗。1～2ml0.05%胰蛋白酶-0.53m M EDTA加入培养瓶中在36°C ± 2°C孵育5-10分钟。当细胞开始变圆时，移除胰蛋白酶，在36°C ± 2°C再次孵育。
2.当大约90%细胞分离时，使用10ml大豆胰蛋白酶抑制剂终止胰蛋白酶活性。细胞悬液转移到15ml无菌离心管，在室温下40g离心5分钟。细胞重新制成悬液并按上述方法再次离心。
3.角质形成细胞使用3～5ml*培养基轻柔的吹打成悬液，细胞大约1～3×106 放入75cm2组织培养瓶中，并加入15ml*培养基。
4.细胞培养： 36°C ± 2°C，5% CO2的空气中。角质形成细胞培养液约每2～3天更换一次，当达到60%～75%融合后，即可进行传代。

2进行细胞冻存时，该注意些什么？
问＆答-------------------------------------------
细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。目前，细胞冻存zui常用的技术是液氮冷冻保存法。其方法是将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样只要在需要的时候再复苏细胞就可用于实验。进行细胞冻存时，该注意些什么？
(1)原代细胞在冷冻过程中在-20℃冰箱内放置时间不可超过1 小时，以防止冰晶过大而破坏细胞。也可跳过-20℃这一步骤直接放入-80℃冰箱中，但这样做细胞存活率要低一些。
(2)DMSO稀释时会释放大量热量。因此，DMSO 不能直接加到细胞液中，必须事先配制。
(3)DMSO必须是细胞培养级别的。新买的DMSO 本身处于无菌状态，*次开瓶后应立即少量分装于无菌试管或瓶中，4℃保存。避免反复冻融造成DMSO 裂解产生有害物质。并可减少污染机会。如要过滤DMSO，必须选用耐DMSO 的尼龙滤膜(millipore)。细胞冷冻保存液主要成分：冷冻保护剂，基础培养液，血清或蛋白。

3细菌、支原体等微生物污染在细胞培养中有哪些特点？
问＆答-------------------------------------------
细胞培养中的微生物污染种类可分成细菌、支原体、真菌和病毒污染。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之胎牛血清和污染之细胞等。细菌、支原体等微生物污染在细胞培养中有哪些特点？
1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。
2、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中zui常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死掉。
3、真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。
4、病毒：组织细胞培养过程中，如果没有除去潜在的病毒，就会产生病毒污染。目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。 尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但疫苗是不安全的。因此，潜在病毒是细胞大量和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。
那么确定细胞受到哪种微生物污染之后，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。
高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在原代细胞使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。